Il museo si articola in venti sale secondo un percorso  cronologico va dall’alto Medioevo all’Ottocento.

PIANO TERRENO
Le sale del piano terreno sono dedicate all’esposizione di frammenti lapidei, di rilievi e sculture di epoca altomedievale e romanica provenienti dalle diverse aree del territorio.
Vi sono esposti gruppi scultorei provenienti dalle chiese aretine e in particolare dall’antica facciata e dall’interno del Duomo. Di notevole interesse è il San Michele Arcangelo e  le statue raffiguranti Madonna col Bambino, anticamente poste a protezione delle porte di accesso della città. Si conservano inoltre dipinti del XIII secolo, come le tavole di Margarito d’Arezzo, primo significativo artista aretino, e il prezioso scapolare di Gregorio X, papa morto ad Arezzo nel 1276.
Vi sono inoltre allestite vetrine con alcuni esemplari delle collezioni di glittica,  di placchette, di bronzetti  e di oreficerie che documentano le antiche radici dell’arte orafa aretina.
Nel cortile, invece, sono collocate numerose colonne e capitelli duecenteschi provenienti dall’abside della Pieve di Santa Maria e altri frammenti architettonici.

PRIMO PIANO
Le tre sale iniziali presentano opere che ben compendiano  lo svolgersi dell’arte dal XIII al XV secolo, come alcune tavole raffiguranti Madonna col Bambino di ambito fiorentino, del senese Pietro Lorenzetti, ma anche angeli del Guariento, il San Michele Arcangelo di Buonamico Buffalmacco. Numerosi poi gli affreschi staccati, provenienti da diverse località della provincia, opera di Giovanni di Agnolo di Balduccio, di Andrea di Nerio e soprattutto della significativa personalità di Spinello Aretino e del figlio Parri,  qui rappresentato con la tavola della Madonna della Misericordia e con gli affreschi staccati del ciclo dell’Annunciazione provenienti dal Duomo vecchio.
Si passa poi ad una piccola saletta che conserva una squisita collezione di vetri, variegata sotto il profilo tipologico e cronologico, per arrivare nella quarta e nella quinta sala dove si conservano opere che testimoniano l’influenza di Piero della Francesca sulla pittura aretina, tra cui  le opere di Bartolomeo della Gatta, come San Rocco, ma sono presenti anche Lorentino d’Andrea, Neri di Bicci, il grande camino del Mosca e le sculture in terracotta Bernando Rossellino e di Michele da Firenze, e l’urna reliquiario dei santi Lorentino e Pergentino di Niccolò di Giovanni da Borgo Sansepolcro.
Continuando la visita si entra nella sezione delle maioliche con una sala dedicata alle robbiane tra cui  una pala della bottega di Andrea della Robbia raffigurante Madonna col Bambino e i santi Sebastiano e Giuliano. La collezione di maioliche presente nel Museo può essere considerata tra le più importanti d’Italia sia per la qualità dei manufatti sia perchè offre un panorama vario ed esaustivo sulle diverse tipologie e sui centri di produzione delle principali aree geografiche della penisola. Conta circa cinquecento pezzi, provenienti dalla fusione delle collezioni della Fraternita dei Laici e dell’erudito Vincenzo Funghini, tra cui, oltre ad un discreto nucleo di opere di officine spagnole, ceramiche di Casteldurante, Montelupo, Venezia, Pesaro e Urbino, Firenze, Gubbio, Faenza e Deruta.
Nel grande corridoio del primo piano si conserva l’eccezionale Convito per le nozze di Ester e Assuero eseguito da Giorgio Vasari per il refettorio della Badia delle SS. Flora e Lucilla in Arezzo,  una delle opere più famose del pittore aretino e tra i dipinti su tavola più grandi del Cinquecento italiano. Dal corridoio ci si immette poi nelle due sale dedicate alla Collezione Salmi, illustre storico dell’arte che si occupò del primitivo allestimento del museo allora comunale, con una settantina di opere, tra cui dipinti di Ludovico Carracci, di Alessandro Magnasco, di Adriano Cecioni.

SECONDO PIANO
Al secondo piano l’esposizione prosegue con la seconda parte della pinacoteca dedicata all’arte dal XVI al XX secolo. Nelle prime due sale sono conservate, tra le altre opere, le grandi tavole della tarda attività di Luca Signorelli, di Domenico Pecori, allievo di Bartolomeo della Gatta, del Cigoli, di Jacopo Vignali e soprattutto di Giorgio Vasari come L’immacolata Concezione, la pala Camaiani, lo stendardo di San Rocco.
Sono inoltre presenti alcune teche che espongono numerosi esemplari della collezione, di circa 3600 pezzi, di sigilli, monete (1500 ca) tra cui 150 monete aretine che coprono tutto l’arco di attività della zecca cittadina, medaglie (710 ca) e tessere mercantili medievali (280).
Nelle ultime sale, oltre ad opere tardo cinquecentesche di Santi di Tito, il Seicento e il Settecento sono documentati, tra gli altri, dipinti di Salvator Rosa, Carlo Dolci, Andrea Pozzo, Viviano Codazzi e degli aretini Salvi Castellucci e Bernardino Santini, mentre la sala dedicata all’Ottocento offre una serie di significativi ritratti di personaggi della società aretina tra cui Tommaso Sgricci, Gaspare Bonci e gli autoritratti Pietro Benvenuti, Raimondo Zaballi, Amos Cassioli, e diversi dipinti a documentare la pittura storica del periodo, come un grande quadro  di Tommaso Sebastiani raffigurante Il giovane Michelangelo e Lorenzo il Magnifico.
Vi è inoltre una sostanziosa rassegna di piccoli dipinti macchiaioli tra cui Giovanni Fattori,  Telemaco Signorini, Luigi Gioli, per terminare con il busto, realizzato da Lorenzo Bartolini, di Vittorio Fossombroni, matematico, economista e ingegnere, al quale si deve la bonifica della Valdichiana.