Il Museo del Cenacolo di Andrea del Sarto è situato negli ambienti dell’antico convento dei monaci benedettini vallombrosani dedicato a San Salvi. L’Abbazia, fondata nel secolo XI, fu  ampliata e  restaurata  a partire all’inizio del secolo  XVI sotto la direzione di Biagio Milanesi e poi dell’abate  Ilario Panichi.  Il grandioso progetto di ampliamento comportò la costruzione del  porticato sud del loggiato,  della cucina, della sala del   lavabo e  del refettorio, dove nel 1511 fu commissionato  ad Andrea del Sarto l’affresco con l’Ultima Cena, poi ultimato nel 1526.
Andrea del Sarto, che si ispirò al famoso Cenacolo di Leonardo da Vinci a Milano, coglie gli apostoli nel momento in cui ricevono l’annuncio del tradimento da Gesù e aggiunge nella parte superiore una piccola e originale scena di due personaggi affacciati a una terrazza che assistono all’evento. I disegni preparatori per le figure indicano il lungo studio preliminare a questa pittura così grandiosa e vibrante dalla comunicativa immediata, così ricca di sfumature preziose rese con eccezionale maestria nella tecnica veloce dell’affresco.
Secondo il racconto  riferito da Benedetto Varchi, vent’anni più vecchio, la bellezza dell’affresco salvò quella parte del convento dalla rovina ordinata dalla Repubblica fiorentina perché gli edifici fuori le mura non offrissero riparo all’esercito di Carlo V, inviato ad assediare Firenze nel 1529.
Al 1511 risale la decorazione del sottarco della volta, alla quale collaborarono  per le grottesche Andrea di Cosimo Feltrini e, probabilmente, il Franciabigio. Vi sono raffigurati San Giovanni Gualberto, San Salvi, la Trinità (al centro), San Bernardino degli Uberti e San Benedetto.

Nel percorso museale allestito negli ambienti del convento, il corridoio, la cucina, la sala del lavabo, il refettorio, sono esposti dipinti del secolo XVI che documentano con eccellenti esempi la pittura fiorentina dell’epoca. Tra questi opere di Pontormo (in particolare Fede e Carità, al lato opposto del refettorio, sopra l’entrata), Franciabigio, Raffaellino del Garbo, Bachiacca, Carlo Portelli, Bernardino Poccetti e un nucleo di dipinti di Plautilla Nelli (1524–1588) una delle rare artiste di cui parla Giorgio Vasari nelle Vite.
In una sala sono esposti i raffinati marmi di Benedetto Rovezzano (1505) per il  Monumento funebre a San Giovanni Gualberto, fondatore dei vallombrosani, complesso  rimasto incompiuto.

Con la gestione della Direzione regionale musei della Toscana negli ultimi anni è stato protagonista di importanti iniziative culturali tra le quali il progetto di Virgilio Sieni Cenacoli Fiorentini_Grande Adagio Popolare e sede principale dei Concerti al Cenacolo_Musica antica nell’area metropolitana fiorentina dell’Associazione L’Homme Armé.

Il Museo è accessibile alle persone disabili.